Roberto Fabián Ayala nació el 13 de abril de 1973 en Paraná, Entre Ríos. Se destacó como defensor central, aunque también supo jugar de lateral en reiteradas ocasiones. Sus inicios en el mundo del fútbol fueron a sus cortos 19 años. Debutó en Ferrocarril Oeste de la mano de Timoteo Griguol. Jugó durante cuatro temporadas, desde 1992 a 1994.
Sus grandes actuaciones dieron lugar al interés de Boca y River por su contratación. Finalmente, fue el equipo Millonario quien se quedó con su pase en 1994. Eventualidad que resultó muy beneficiosa para el zaguero, ya que compartió plantel con grandes jugadores de la historia de River, como Marcelo Gallardo, Ariel Ortega y Leonardo Astrada, entre otros. En ese plantel, se consagró campeón invicto, por primera vez en su historia, del Torneo Apertura de 1994. Con Américo Gallego como entrenador, y nada menos que el Principe Enzo Francescoli como referente, Ayala supo ganarse su lugar en el equipo titular e incluso fue una importante pieza para la obtención del título.
En 1995 pasó al Napoli de Italia y jugó hasta 1998. No consiguió ningún título en Napoli, pero sus altos rendimientos le permitieron seguir siendo convocado por su país.
En 1998 debutó en el Milán, donde sumó un título a su cuenta personal. Compartió plantilla con grandes ídolos del club como son Paolo Maldini y Genaro Gattuso. Dirigidos por el italiano Roberto Zaccheroni, se consagraron campeones de la Liga Italiana.
En el año 2000 pasó a otro país europeo. Fue fichado por el Valencia, de España, club donde transcurrió la mayor parte de su carrera futbolística. Jugó 7 años y se volvió un verdadero ícono del club español, incluso fue reconocido como mejor defensor central de la historia del club. En 2003 el Real Madrid ofreció 14 millones de euros por el traspaso del defensor, pero las negociaciones no llegaron a buen puerto. Obtuvo dos campeonatos de Liga, en 2002 y 2004. El 2004, fue un gran año para Fabián Ayala, ya que además del campeonato de liga también obtuvo la Copa UEFA y la Supercopa de Europa.
En 2007 dejó el Valencia para pasar a formar parte del Villarreal, aunque disputó una sola temporada. De 2007 a 2009, desarrollo los últimos pasos de su carrera en el Real Zaragoza. En su primer año en el plantel, el Zaragoza descendió a la segunda división del futbol español. Sin embargo, con el Ratón como una de sus grandes figuras, el equipo volvió a conseguir un lugar en primera división.
En 2010 Roberto Ayala volvió a la Argentina, pero esta vez jugaría en Racing. Jugó escasos partidos como titular y se retiró definitivamente del fútbol en diciembre de ese año. Fue manager del equipo de Avellaneda hasta el 2012. En 2013 volvió a España para ocupar ese mismo cargo, pero en Valencia, donde desempeña su nueva profesión hasta la actualidad.
Roberto el Ratón Ayala es el segundo jugador con más partidos con la celeste y blanca hasta la actualidad, con un total de 115 partidos y 7 goles. El primero es Javier Zanetti.
En 1993 fue convocado por primera vez a la Selección Nacional por Alfio Basile, aunque no sumó minutos. Las buenas actuaciones en River en 1994, le permitieron una nueva oportunidad en la Selección Argentina, donde debutó en una victoria del albiceleste por 3 a 0 a Chile. Fue el primero de tantos partidos del Ratón en la selección nacional.
En 1995 formó parte del plantel que obtuvo la dorada en los Juegos Panamericanos, y la Copa América jugada en Uruguay. Y en 1996, del equipo sub-campeón de los Juegos Olímpicos de Atlanta. Tres años más tarde, participó del Mundial de Francia del 98. Argentina llegó a cuartos de final y el Ratón disputó los 5 partidos. Participó de la Copa América 1999, sin mayor trascendencia.
En 2002 estuvo presente en el Mundial Corea - Japón , sin embargo, no sumó minutos por una lesión en el entrenamiento del primer partido. La Selección Argentina quedó eliminada en fase de grupos.
En 2004 participó nuevamente de los Juegos Olímpicos. La selección que tenia jugadores como Javier Saviola, Javier Mascherano y Carlos Tevez, consiguió el oro en Atenas. Ese mismo año disputó la Copa América de Perú.
En 2006 participó del Mundial de Alemania, en el que Argentina quedó eliminada en cuartos de final contra los anfitriones. Ayala jugó los 5 partidos y marcó un gol.
En 2007 se retiró de la selección tras la derrota en la final por la Copa América frente a Brasil. El ratón Ayala marcó un gol en contra en el arco defendido por Roberto Abondanzzieri.
En 2008, Diego Armando Maradona lo convocó para disputar los partidos por Eliminatorias, pero fue el mismo Ayala quien decidió no estar presente.
Único gol de Roberto Ayala en un Mundial.